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以高分子奈米微粒自組裝技術開發成新型態messenger RNA (mRNA)禽流感疫苗

為了解決vero cell疫苗中文的問題，作者張正忠 這樣論述：

禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)對全世界的家禽產業及人類有巨大的威脅，因此需要有效的疫苗來防止大流行。現今的禽流感疫苗多由雞蛋培養禽流感病毒，再經由去活化作用而生成，然而面對快速傳佈的禽流感疫情時，以雞蛋生產疫苗無法快速反應病原變化，而且需在安全等級高的場所生產。訊息RNA (messenger RNA) 為細胞進行genomic DNA轉錄後的產物，可直接用於蛋白質生產，也不會有轉錄的DNA後模板殘留，以及對genomic DNA嵌插產生基因突變的安全性疑慮。目前已經有一些研究使用mRNA作為疫苗的抗原表現工具，例如Pfizer-BioNTech以及Mod

erna的COVID-19疫苗，證實mRNA疫苗具有啟動細胞免疫反應的效果。此外，mRNA會引起細胞Toll-Like Receptor (TLR)介導之免疫反應，本身即可提供作為一良好的疫苗佐劑。因此，本研究希望能以我們實驗室自行開發的高分子奈米載體遞送mRNA表現抗原，以驗證作為新型禽流感疫苗的可行性與動物免疫效果。在此研究中，我們以體外轉錄合成(in vitro transcription, IVT)系統，首先建構IVT反應所需要之基因模板，用於製備無自我複製型以及具有自我複製功能之mRNA，表現禽流感病毒的主要抗原，即血球凝集素(hemagglutinin, HA)。然後以不同結構修飾

的PEGylated polyaspartamide block copolymer遞送抗原血球凝集素mRNA，自組裝形成mRNA nano micelles vaccine，進行物化性質分析。並且比較在小鼠不同部位接種，刺激產生的免疫反應，包括體液免疫反應，測試免疫抗體效價以及血球凝集抑制效價。細胞性免疫反應，測試免疫小鼠脾臟細胞interferon- (IFN-)及interlukin-4 (IL-4)細胞激素表現，綜合評估將來開發成禽流感疫苗的潛力。結果顯示，我們所建構的IVT模板與技術，可以產製高純度與鏈長完整之短效型與長效型HA mRNA，在體外轉染家禽細胞後，也能產生完整HA抗

原蛋白。在體內動物試驗，證實以報導基因Luc2 mRNA注射小鼠肌肉，可以產生達9天以上之Luc2重組蛋白表現。在小鼠免疫試驗證實，產生達8倍以上之IgG抗體效價，並具有顯著血球凝集抑制效果，免疫小鼠脾臟細胞，具辨識AIV 抗原能力，分泌IFN-與IL-4細胞激素。本研究是第一個採用聚氨基酸奈米載體包覆AIV HA mRNA的設計，評估作為疫苗的效果，對於未來推廣mRNA vaccine作為禽流感或其他動物疾病預防疫苗，具有參考指標意義。

以反向基因工程探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒第一與二型之分子致病機制：分析NLRP3/CXCL10介導發炎反應及高關注變異株感染力

為了解決vero cell疫苗中文的問題，作者張勇昇 這樣論述：

致謝 I中文摘要 IIABSTRACT IV目錄 VI圖表目錄 XI第一章、 文獻探討 1第一節、 緒論 1第二節、 冠狀病毒屬（Coronavirus genus） 21. 甲型–冠狀病毒（Alpha-coronavirus, α-CoV） 22. 乙型–冠狀病毒（Beta-coronavirus, β-CoV） 33. 丙型–冠狀病毒（Gamma-coronavirus, γ-CoV） 34. 丁型–冠狀病毒（Delta-coronavirus, δ-CoV） 3第三節、 人類冠狀病毒的流行病學（Epidemiology of human coro

navirus） 41. 嚴重急性呼吸道綜合症冠狀病毒–一型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-1, SARS-CoV-1） 42. 中東呼吸道綜合症冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV）…………………………………………………………………………………………………….. 53. 嚴重急性呼吸道綜合症冠狀病毒–二型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2, SARS-CoV-2） 63.1.

SARS-CoV-2高度關注變異株（Variants of Concern,VOCs） 6第四節、 人類冠狀病毒的傳播（Transmission of human coronavirus） 8第五節、 SARS-CoV-1與2的結構與基因組 （Structure and genome of SARS-CoV-1 and 2）…………………………………………………………………………………………… 91. 結構（Structure） 92. 基因組（Genome） 93. SARS-CoV-1與SARS-CoV-2基因組的差異（Sequence identity of SA

RS-CoV-1 and 2）……………………………………………………………………………………………………….. 104. 非結構性蛋白（Non-structural proteins） 103.1. 非結構性蛋白3（Non-structural proteins 3） 113.2. 類木瓜蛋白酶（Papain-like protease） 113.3. 嚴重急性呼吸道病毒–一型獨特蛋白結構域（SARS-CoV-1 unique domain） 123.4. 3–凝乳蛋白樣酶（3-chymotrypsin-like protease） 133.5. RNA依賴性RNA聚

合酶（RNA-dependent RNA polymerase） 134. 結構蛋白（Structural proteins） 144.1. 刺突蛋白（Spike protein） 144.2. 套膜蛋白（Envelope protein） 154.3. 膜蛋白（Membrane protein） 154.4. 核殼蛋白（Nucleocapsid protein） 155. 輔助蛋白 (Accessory proteins) 16第六節、 SARS-CoV-1與2的感染及複製機制（Infection and life cycle of SARS-CoV-1 and

2）……………………………………………………………………………………….. 161. SARS-CoV-1的感染（Infection of SARS-CoV-1） 162. SARS-CoV-2的感染（Infection of SARS-CoV-2） 173. SARS-CoV-1與2的複製機制（Replication of SARS-CoV-1 and 2） 18第七節、 嚴重急性呼吸道症候群與嚴重特殊傳染性肺炎-2019的臨床症狀（Clinical features of SARS and COVID-19） 181. 嚴重急性呼吸道症候群的臨床特徵 （Clinical

features of SARS） 182. 嚴重特殊傳染性肺炎-2019的臨床特徵 （Clinical features of COVID-19） 19第八節、 免疫反應（Immune response） 201. 細胞激素風暴 （Cyokine strom） 202. 類鐸受體（Toll-like receptors） 212. RIG樣受體（RIG-I-Like receptors） 223. NOD樣受體（Nucleotide oligomerization domain-like receptors） 224. NLRP3發炎小體（NLRP3 infla

mmasome） 235. 細胞激素（Cytokines） 245.1. 介白素-1β（Interleukin-1β） 245.2. 介白素-6 （Interleukin-6） 255.3. 趨化激素CXC motif chemokine 10 255.4. 乙型-轉型生長因子（Transforming growth factor-beta） 26第九節、 嚴重急性呼吸道症候群病毒第二型的預防與治療（Prevention and treatment of SARS-CoV-2） 271. 疫苗（Vaccines） 272. 藥物（Drugs） 28第十節、

病毒樣顆粒（Virus-like particle, VLP） 29第十一節、 病毒複製子（viral replicon） 30第十二節、 單次感染性顆粒（Single round infectious particle） 31第二章、 研究動機、目的及實驗設計 33第一節、 探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒的獨特結構域誘導NLRP3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLRP3 Inflammasome-Depen

dent CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 331. 研究動機（Motive） 332. 研究目的 （Aim） 343. 實驗設計 （Experimental design） 353.1. 探討SARS-CoV-1 SUD誘導細胞發炎反應（Investigation of inflammatory response induced by SARS-CoV-1 SUD） 353.2. 探討SARS-CoV-1 SUD誘導小鼠肺發炎反應（Investigation of pneumonia induced by SARS-CoV-1

SUD in mice） 35第二節、 SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Induction of pulmonary inflammation by SARS-CoV-2 Virus-like particle and Single round infectious particle） 361. 研究動機（Motive） 362. 研究目的（Aim） 373. 實驗設計（Experimental design） 383.1. SARS-CoV-2單次感染性顆粒製備（Preparation of SARS-CoV-2 SRIP） 38

3.2. 評估SARS-CoV-1 and 2單次感染性顆粒誘導肺部致病機制（Assessing the pathogenesis of SARS-CoV-2 SRIP） 383.3. 分析SOmiEM/CoV-2 SRIP在中和試驗之敏感性（Analyzing sensitivity of SOmiEM/CoV-2 SRIP for neutralization assay） 39第三章、 實驗材料與方法（METERIAL AND METHOD） 40第一節、 實驗材料（Meterial） 40第二節、 實驗方法（一）：探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒的獨特結構域誘導NLR

P3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLRP3 Inflammasome-Dependent CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 481. 細胞株 (Cell strain) 482. SARS-CoV-1 SUD與子結構域質體的構築（Construction of SARS-CoV-1 SUD and sub-domain plasmid） 483. 聚合酶連鎖反應（Po

lymerase chain reaction, PCR） 494. 聚合酶連鎖反應產物純化（PCR products purification） 495. 限制酶酵素反應（Restriction enzyme digestion） 506. DNA接合（DNA ligation） 507. 質體轉型（Plasmid transformation） 508. 菌落篩選（Colony screening） 519. CXCL10報導基因質體（CXCL10 repoter plasmids） 5110. 質體純化（Plasmid purification） 5111.

SARS-CoV-1複製子萃取（SARS-CoV-1 repicon extraction） 5212. 短暫轉染（Transient transfection） 5313. 建立SUD穩定表達細胞株（Establishment of SUD expressing cell line） 5314. 萃取細胞內與肺臟組織總核醣核酸（Extraction of cell and lung tissues total RNA） 5315. 即時定量聚合酶連鎖反應（Quantitative real time polymerase chain reaction, q-PCR）………

…………………………………………………………………………………………… 5416. 雙冷光素酶報導基因檢測（Dual-Luciferase Reporter Assay） 5517. 免疫螢光染色（Immunofluorescence staining） 5518. 間接-酵素連結免疫吸附分析法（indirect enzyme-linked immunosorbent assay） 5619. 西方墨點法（Western blot）與斑點印跡法 （dot-blot） 5620. 小鼠動物模型（Animal model） 5721. 流式細胞儀分析（Flow cytome

try assay） 5822. 組織病理學與免疫組織化學染色分析（Histopathology and immunohistochemistry assays）…………………………………………………………………………………………………. 5823. NLRP3抑制劑處理（NLRP3 inhibitor treatment） 5924. 統計分析（Statistical analysis） 59第三節、 實驗方法二：SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Induction of pulmonary inflammation by SARS-CoV

-2 Virus-like particle and Single round infectious particle） 601. 細胞株 (Cell lines) 602. SARS-CoV-2 SWH1EM與SOmiEM質體的構築（Construction of SARS-CoV-2 SWH1EM and SOmiEM plasmid） 603. SARS-CoV-2病毒樣顆粒的生產與濃縮（Production and concentration of SARS-CoV-2 VLP）…………………………………………………………………………………………………… 614. 反轉

錄-即時定量聚合酶連鎖反應（Reverse transcription-Quantitative real time polymerase chain reaction, RT-qPCR） 625. 西方墨點法（Western blot） 636. 穿透式電子顯微鏡 （Transmission electron microscope, TEM） 647. 單次感染性感染顆粒的生產（Production of single round infectious particle） 648. 冷光酶分析（Luciferase assay） 649. SARS-CoV-1與2單次感染

性感染顆粒的感染（Infection of SARS-CoV-1 and 2 SRIP）…………………………………………………………………………………………………... 6510. Remdesivir與GC376抑制SRIP活性試驗（Inhibition of SARS-CoV-2 SRIP by Remdesivir and GC376） 6511. 疫苗免疫血清分析SWH1EM與SOmiEM VLP之抗原性 （Antigenicity of SARS-CoV-2 VLP by immunized serum） 6612. SOmiEM/CoV-2 SRIP之疫苗免疫血清中和能

力（Neutralization of SARS-CoV-2 SRIP by immunized serum） 6613. 免疫螢光染色（Immunofluorescence staining） 66第四章、 結果 (RESULTS) 68第一節、 結果一（Result 1）：探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒的獨特結構域誘導NLRP3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLRP3 Inflammasome-Depende

nt CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 681. SARS-CoV-1-SUD誘導人肺上皮細胞中趨化激素的表達 681.1. 建立SARS-CoV-1 SUD質體與人肺上皮細胞中的表達 681.2. SUD-MC子結構域上調人肺上皮細胞中CXCL10的表達 691.3. SUD-MC子結構域活化AP1介導的CXCL10表達機制 702. SARS-CoV-1 SUD誘導小鼠模型肺部發炎 712.1. 透過氣管滴入SUD質體誘導小鼠肺部發炎反應 712.2. SUD-MC誘導小鼠肺部細胞激素與趨化激素之表現 732.3.

SUD-MC活化NLRP3發炎體介導CXCL10在肺發炎的表現 74第二節、 結果二（Result 2）：SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Mechanism of pulmonary inflammation in SARS-CoV-2 Virus-like particle and Single round infectious particle） 761. 構築SARS-CoV-2 S-E-M表達質體 762. 製造SARS-CoV-1與2單次感染性顆粒 773. SARS-CoV-1與2的單次感染性顆粒之感染力 784. 評估

SWH1EM/CoV-2 rep SRIP發展抗病毒藥物篩選平台之敏感性 795. 分析SWH1EM/CoV-1 rep SRIP與SWH1EM/CoV-2 rep SRIP誘導人類肺細胞（calu-3）發炎……………………………………………………………………………………………………… 806. 篩選抗SWH1EM/CoV-1 rep SRIP與SWH1EM/CoV-2 rep SRIP之潛力藥物 817. 評估疫苗免疫血清對SOmiEM/CoV-2 rep SRIP的中和能力 82第五章、 討論（Discussion） 84第一節、 討論一（Discussion 1）：探

討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒-1的獨特結構域誘導NLRP3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLRP3 Inflammasome-Dependent CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 84第二節、 討論二（Discussion 1）：SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Induction of pulmonary inflammation by

SARS-CoV-2 Virus-like particle and Single round infectious particle） 87第六章、 結論與未來展望（CONCLUSION AND FUTURE PROSPECTS） 90第一節、 結論（Conclusion） 901. 結論一（Conclusion 1）：探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒的獨特結構域誘導NLRP3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLR

P3 Inflammasome-Dependent CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 902. 結論二（Conclusion 2）：SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Mechanism of pulmonary inflammation in SARS-CoV-2 Virus-like particle and Single round infectious particles） 91第二節、 未來展望（ Future prospects） 91