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探討不同發酵策略對於Klebsiella sp. Ana-WS5生產1，3-丙二醇與2，3-丁二醇之影響

為了解決天然藥物研究所ptt的問題，作者李芳慈 這樣論述：

探討不同發酵策略對於Klebsiella sp. Ana-WS5生產1，3-丙二醇與2，3-丁二醇之影響研究生：李芳慈指導老師：顏宏偉摘要--本研究為探討利用不同碳源培養Klebsiella sp. Ana-WS5以同時生產2，3-丁二醇（BDO）和1，3-丙二醇（PDO），並嘗試利用不同發酵控制增加BDO與PDO之生產濃度。根據搖瓶批次實驗的結果發現，以甘油 (70 g/L)為單一碳源生產BDO (21.7 g/L)與PDO (10.3 g/L)的效果較佳；以粗甘油 (70 g/L)為單一碳源時，會使菌體濃度下降 (2.2 g/L)，但其培養基經發酵後pH均能維持高於5.0，有助於PDO合

成 (14.9 g/L)；而以相同濃度的混合碳源 (甘油與葡萄糖，濃度分別為50 g/L、20 g/L)反而會導致BDO (5.9 g/L)與PDO (2.1 g/L)產物濃度下降；先前的文獻指出，培養基中添加醋酸有助於BDO的生產；本實驗研究結果發現添加乳酸具有類似醋酸添加的效果，亦可以提升同時生產的BDO與PDO，並且添加10 g/L的乳酸能有效地提升30 %的Total Diols產量 (30.8 g/L至39.4 g/L)。包埋法固定化細胞培養，凝膠球粒徑較小 (1.3 mm)有助產物的生產；不同凝膠球顆粒數因為pH過低的影響，無明顯的差別；重複批次實驗可以有效的重複三次，BDO和PD

O均能維持約20 g/L、11 g/L；連續式放大培養BDO、PDO生產速率分別是0.27 g/Lh、0.20 g/Lh，產率分別為0.29 g/g、0.54 g/g。細胞固定化對產物的生產沒有特別的提升效果，但有利進行重複批次實驗。不同溶氧量對菌體生長及BDO與PDO生產也有不同影響，高溶氧批次發酵，有助於菌體生長 (2.8 g/L)、提高BDO的濃度 (30.1 g/L)、生產速率 (0.42 g/Lh)、產率 (0.43 g/g)；低溶氧批次發酵反而有利於PDO的生產，提升PDO濃度 (17.2 g/L)、生產速率 (0.13 g/Lh)、產率 (0.59 g/g)。固定pH 7.0的策

略，能單獨提升PDO的最大濃度 (25.0 g/L)、生產速率 (0.33 g/Lh)約為控制組 (無pH調整)兩倍之多；雖然在探討固定時間間距調整pH (12 hr、24 hr)之批次策略無法有效提升BDO及PDO之最大濃度，但相對於控制組生產速率方面卻有大幅度的增加，BDO (0.21 g/Lh)、PDO (0.42 g/Lh)；固定時間間距調整pH (24 hr)之間隔式饋料批次策略皆在Total Diols的最大濃度 (74.3 g/L)、反應速率 (0.83 g/Lh)有相當的提升，連續式饋料能改善間隔式饋料產物延遲生產的問題，但對產物的生產沒有明顯的影響。氣舉式發酵槽具有較好的溶氧

速率且無機械攪拌葉片之剪切力的產生，相對於攪拌式發酵槽，有利於菌體的生長 (3.0 g/L)與BDO (22.2 g/L)的生產。總結，本次研究結果顯示，以Klebsiella sp. Ana-WS5 生產BDO和PDO對於發酵液中溶氧量、pH的變化、發酵槽型式是相當敏感的，細胞固定化培養則有利於重複批次實驗。此外，乳酸添加、溶氧的改變、固定時間間隔調整pH之饋料批次實驗皆是簡單又有效的方式作為提高BDO和PDO生產的發酵策略。關鍵字：2，3-丁二醇、1，3-丙二醇、乳酸、pH、溶氧量一、緒論1-1 前言當今石化能源涵蓋了生活中的食衣住行，石化能源與現代人類生活已密不可分。人口的急速增加、工業

科技的快速發展導致對石化能源的需求量高度成長。國際能源情勢方面，於二十一世紀中石油、天然氣、煤炭等石化燃料即將枯竭，但人類的需求量仍然持續增加，因此價格也不斷攀升。而高度依賴石化能源，對地球環境也帶來極大影響，例如溫室效應、全球暖化、海平面上升等，因此開發替代再生能源將成為全球關注的議題之一。全球石化燃料的日益短缺、價格飆漲，受限於此天然資源的問題，非石化原料來源的綠色化學品，將是未來重要的化學品來源。因此利用微生物發酵法生產化學品已逐漸引起關注。1-2 研究動機本研究所使用的菌株Klebsiella sp. Ana-WS5為能同時生產2，3-丁二醇（BDO）和1，3-丙二醇（PDO），故利用

不同的碳源與不同的發酵策略對於產物BDO與PDO的分布進行一連串的研究，所使用的發酵策略有(1)溶氧、(2)固定pH、(3)固定時間間距調整pH。另外，文獻指出於培養基中添加醋酸、乙醇能有效提升產物產量，本研究則為添加亦為副產物的乳酸，以觀察其對產物的影響。為了有效地重複使用微生物細胞，利用載體為海藻酸鈉之包埋法進行細胞固定化，並探討不同固定化條件對於產物生產的影響。二、文獻回顧2-1 BDO介紹BDO的開發起始於1906年，由Harden和Walpole首次利用微生物轉換法以Klebsiella pneumonia生產 (Harden and Walpole, 1906)。如今石化燃料的短

缺，石油價格不斷的上升，以微生物發酵法生產BDO再次受到重視。BDO，C4H10O2，分子量90.12，無色結晶固體或黏稠液體，溶點23~27 ℃，沸點179~182 ℃，密度為1.05 g/cm3，燃燒值為27198 J/g，能溶於水、醇和醚類。BDO應用相當廣泛，應用範圍有燃料、化工、食品、燃料、醫學、交通等多種領域中。例如BDO具有高燃燒值，是一種極具價值的液體燃料可以作為航空燃料；具有較低凝固點的特性可用作抗凍劑。另外，也可以應用於化妝品、香水、藥物載體、染料、印刷油墨、炸藥等 (Garg and Jain, 1995；Syu, 2001)。目前的生產BDO主要分為兩種方法，一是化學合

成法，但化學合成法有其缺點為必須在高溫高壓高單價觸媒的環境下進行合成，成本較高，又因BDO結較為複雜，相對的困難度也會提升。而用微生物發酵法來生產BDO，其優點為操作會比較簡單，且可以利用工業廢料當成營養源，成本也會降低，亦符合現在所提倡的綠色化工，所以微生物發酵法是現在生產BDO較受歡迎的方法 (Wong et al., 2012)。2-2 PDO介紹 PDO是已知最古老的發酵產物之一，它早在1881年由August Freund以Clostridium pasteurianum加入含有甘油的混合培養基發酵生產而得的中間體化合物，一種可直接利用微生物轉化合成之非石化來源之綠色化學品 (B

iebl et al., 1998；Reimann et al., 1998)。PDO，分子式C3H8O2，分子量76.09 ，無色或淡黃色的黏稠液體，略有刺激的味道，溶點-32 ℃，沸點214 ℃，密度為1.053 g/cm3，與水、乙醇、丙酮等多種溶劑互溶。PDO具有良好生物降解性，且不具毒性，是一種重要化工和醫藥中間體原料，可廣泛應用於多種不同產業領域，如高分子、化妝品、食品與醫藥等產業。同時PDO，更是合成新型聚酯—聚對苯二甲酸丙二酯（PTT）的主要單體之一，如圖2-3，PTT具有許多獨特的性質，因此受到國際的廣泛重視 (Biebl et al., 1999；Kurian, 2005)

。生產PDO目前有兩種方法，分別為化學合成法和微生物發酵法。化學合成法，缺點是副產物多、選擇性差、操作條件需高溫高壓、所利用的化學原料均為不可再生的石油或煤碳資源；而微生物發酵法，選擇性高、操作條件溫和、原料可用再生的農產品或工業廢料粗甘油等符合可持續發展的需求，所以越來越受重視。2-3 BDO與PDO代謝路徑圖一為微生物發酵的代謝路徑圖。由圖可發現以甘油為碳源時，代謝產物包含PDO、BDO、乙醇、醋酸、乳酸、琥珀酸，其中PDO通常是甘油發酵的主要產物。研究指出，利用Klebsiella sp.進行甘油發酵的期間，隨著pH減少醋酸的形成會被BDO形成所取代，使得BDO也成為較為主要的產物之一

。圖2-1 產物代謝路徑圖2-4 細胞固定化介紹微生物固定化技術使利用物理或化學程序將微生物定位於特定空間區域中，並使其保持活性，可維持較高的菌體濃度及加快生產速度 (Idris et al., 2006)。具有反應速度快、不易受汙染、產物分離容易、穩定性高、可重複利用等優點。依照固定載體和作用方式不同可分為五種類型:吸附法、交聯法、包埋法、包覆法、共價鍵結法。微生物最常用的方法為包埋法，是將微生物置於天然高分子多醣類或高分子凝膠中，使微生物固定化。其優點有成型方便、對細胞活性影響小、可以製作成各種形狀等 (Sun, 1998)。載體材料的選擇對微生物固定化發酵也是非常重要的因素，理想的固定

化載體應該為穩定性高、對微生物無毒性、質傳性能良好、不易被微生物分解、機械強度高、使用壽命長、價格低廉等。目前，微生物發酵最常使用的固定化包埋法使用的載體材料有瓊脂、海藻酸鈉、聚乙烯醇、聚丙烯醯氨、聚乙烯乙二醇、具丙烯酸等凝膠。其中，海藻酸鈉是由褐藻提取的多醣，故其價格低廉、生物相容性良好且固化、成型方便，是目前使用最廣、研究最多的固定化載體。2-5 影響BDO、PDO產量因素(1) 溶氧量發酵液中的溶氧濃度對微生物的生長和產物BDO、PDO的形成有著重要的影響。在發酵過程中，菌體必須要有適當的無菌空氣才能繁殖和累積代謝物，不同菌種生長、不同代謝路徑所需要的溶氧量都是不相同的，所以研究反應

器內溶氧量對發酵的影響及對代謝產物生產效率、產量是非常重要(Zhang et al., 2007)。Klebsieblla sp.為兼性厭氧菌，由上述可知在好氧和厭氧條件下分別利用兩種不同的途徑代謝甘油能分別得到其主要的代謝產物，在好氧的條件下，甘油代謝由3-磷酸甘油操縱子 (glp)調控；甘油在依賴ATP的甘油激酶催化下磷酸化，生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油在甘油脫氫酶作用下轉化為磷酸二羟丙酮進入酵解途徑，進而生成BDO；在厭氧條件下，甘油的代謝主要由二羟丙酮 (dha)調控，分別為氧化和還原兩條途徑，在氧化途徑，甘油在依賴NAD+的脫氫酶的催化下脫氫轉變為二羟丙酮，二羟丙酮在二羟丙酮激酶的

作用下磷酸化為磷酸二羟丙酮，進而進入酵解途徑生成BDO、乳酸、甲酸、乙醇等代謝副產物。在還原路徑中甘油則是以在甘油脫水酶的作用下轉變為甘油3-羥基丙醛，然後利用氧化還原途徑生產的NADH，在依賴於NADH的1,3¬-PDO-NAD氧化還原酶的作用下生成PDO。GDHt是催化甘油轉化生成PDO代谢途徑中的關键限速酶，因此，後續將可以使用GDHt之酶活性監測不同發酵策略對PDO合成的影響(Wong et al., 2011)。(2) pH發酵液的pH值對BDO、PDO生成途徑的影響作用是非常大的。這是因為BDO生產是一個多副產物的途徑，每種副產物生成途徑的相關酵素最適合的pH並不一致，因此發酵過

成中pH不僅會影響細菌的生長還會影響細菌的代謝過程。微生物以甘油為碳源發酵生產PDO的過程中，經由pH的控制策略可以有效的增加甘油的轉化率和控制副產物生產。目前PDO的發酵生產主要都採用間歇性的發酵過程，隨著甘油濃度的降低及產物PDO的累積，使菌體的生長速度逐漸緩慢，產生嚴重的產物抑制效應 (Ji et al.,2007)。所以可以利用發酵過程中pH的波動加上分批饋料的方式，因為發酵過程中當PDO逐漸增加時，菌體生長的環境也隨著改變，以至於菌體的生長速率下降，使副產物的產量隨之增加，所以將pH維持於中性可以維持菌體的生長速率，也可以降低副產物的大量產生。所以運用此策略可以提高PDO的最終濃度、

提高甘油的轉化率、抑制副產物的生產。無控制pH值的發酵過程中24小時內的pH值自然地快速下降至低點，此過程pH值差約3.5~4.0，此pH的快速下降是由於BDO和酸類的生成。強迫pH值的波動之方法是利用固定時間間距調整pH值，然而發酵液會自發性的降回低點，使發酵過程中能模仿自然發酵中的pH值變化，pH值能於明確的時間間距中不斷震盪。此新方法可以有效的提升BDO和PDO的生產及增加甘油的利用率(Petrov et al., 2010)。本實驗將於固定時間間距 (12 hr、24 hr)將pH值調整至7.0以觀察BDO和PDO之生產變化。(3) 添加醋酸、乙醇的影響文獻曾提出在發酵液中添加醋酸、

乙醇可以有效的提升甘油的利用率和BDO產量的提升，由圖2-1的甘油代謝路徑圖可以發現甘油經由甘油脫氫酶催化作用後可以代謝出BDO、琥珀酸、乳酸、醋酸、乙醇等代謝產物，因此在發酵液中各別添加副產物少量醋酸、乙醇，發現能在甘油代謝過程中產生產物抑制效應，使碳流減少利用於生產此兩種副產物，進而有效利用於BDO的生產 (Zeng e tal., 1990)。本次實驗也是利用此原理，在發酵液中添加亦為副產物的乳酸並測試添加不同濃度的乳酸對BDO與PDO生產的影響。三、材料與方法3-1 實驗材料3-1-1 實驗菌種本實驗所採用的菌株Klebsiella sp. Ana-WS5，具有發酵生產二醇類的能力，

由國立成功大學化工系張嘉修教授所提供。此菌株篩選於國立成功大學實驗所高效率生物消化系統中的污泥，經利用16S rRNA基因序列(圖3.1)與Genbank鑑定後確定菌株種類為Klebsiebllasp.，並命名為Klebsieblla sp. Ana-WS5。圖3-1 Klebsiella sp. Ana-WS53-2 實驗架構圖3-2 實驗架構Ⅰ (懸浮培養)圖3-3 實驗架構Ⅱ (固定化培養)四、結果與討論4-1 搖瓶批次發酵程序（Flask Experiments）4-1-1 不同碳源之影響此實驗為探討不同碳源對於菌體生長及BDO與PDO產量之影響。由圖4-1得知，菌體濃度以甘油為碳源時

最高，約2.3 g/L。BDO以葡萄糖為碳源時產量最高，PDO、Total Diols以甘油為碳源時最高，由於甘油能同時生產BDO與PDO，而葡萄糖主要為生產BDO。以甘油當作碳源，能得到較高的菌體濃度且由代謝路徑可知利用不同發酵策略能分別生產較高BDO與PDO。且由於現今生質柴油產量日益增加，其副產物粗甘油也大量的生產，未來以粗甘油為替代碳源將可以降低生產成本。因此，選定甘油當作後續培養所使用的碳源。圖4-1 不同碳源對菌體生長及產物產量之影響4-1-2 添加不同乳酸濃度之影響文獻指出，當以Klebsiellasp.生產BDO時，若在培養基中添加少許的代謝副產物醋酸或乙醇，會使BDO的產量有

所提升。所以本次實驗為探討添加亦是代謝副產物的乳酸在不同濃度下對菌體生長及BDO與PDO產量之影響。由圖4-2可知，效果以添加10 g/L為最好，較控制組高出30%，其BDO、PDO、Total Diols分別為26.3 g/L、10.8 g/L、37.1 g/L。此結果由圖2-1甘油代謝路徑推測當培養基中添加乳酸，由於產物濃度效應而使甘油代謝路徑向BDO，故提高BDO的產量。圖4-2 添加不同濃度的乳酸對菌體生長及BDO與PDO產量之影響4-1-3 細胞固定化之重複批次實驗本次實驗探討以海藻酸鈉為固定化載體的固定化細胞進行Repeated-Batch實驗對BDO與PDO產量之影響，每一次批次

以96小時為一個循環。由圖4-3所示，固定化細胞在第一批次到第三批次發酵實驗中，雖然主要代謝產物的產量有略微的下降，但BDO和PDO的產量分別都可以維持在20 g/L、11 g/L左右。但在第四批次實驗，凝膠球會開始破裂使菌體流出凝膠球外，推測凝膠球破裂後浸泡於培養基中，造成培養基的改變加上菌體的活性降低，導致主要代謝產物的產量下降。圖4-3 細胞固定化之重複批次實驗對BDO與PDO產量之影響4-2 5-L攪拌式發酵槽批次程序 (Batch)4-2-1 控制溶氧量之影響溶氧量高低會影響菌體的生長與甘油代謝路徑，本次實驗控制溶氧量於高DO值(70 ± 10%)與低DO值(10 ± 10%)之批

次發酵策略，來探討不同的溶氧發酵策略對菌體生長及BDO與PDO產量之影響。由圖4-4所示，在高溶氧策略下，細胞能快速生長並得到較高的菌體濃度2.7 g/L而低溶氧時的菌體濃度僅達1.7 g/L且在主要代謝產物BDO方面，高溶氧發酵和控制組的最大濃度幾乎相同約30.3 g/L，但其BDO的生產速率為0.42 g/Lh遠大於控制組的0.16 g/Lh，約2.6倍之多；於PDO方面，反而於低溶氧的狀態下是較有利於Klebsiella sp.生產PDO，因為其PDO生產速率可達0.27g/Lh是控制組0.12 g/Lh的兩倍左右。由表4-29可發現，由高低溶氧的發酵策略可以使同時生產PDO和BDO的K

lebsiella sp.對生產其中的某一產物選擇性較大，提高其中一個產物的生產量同時降低另一個代謝產物的生產，更有助於後續分離純化的步驟。圖4-4 控制溶氧量之比較4-2-2 固定pH值之影響文獻指出pH值控制於6.0~7.0是較適合Klebsiella sp.生長(Jiet al., 2011)。因此本次實驗分別將pH值控制於6.0、7.0，探討不同的pH值發酵策略對於菌體生長及BDO與PDO產量之影響，由圖4-5可發現，將pH固定於6.0、7.0時，菌體濃度最高為pH固定於7.0。固定pH會使PDO的產量和生產速率明顯的提升。當發酵過程中pH均固定於7.0時，PDO的最大濃度與生產速率能

提升至25.0 g/L、0.33g/Lh；但在BDO方面固定pH值之發酵策略無法對產量或生產速率有所幫助。雖然此方法不利於BDO的生產，但對於菌體生長和PDO生產方面卻是有不錯的進展。圖4-5 固定pH之比較4-2-3 固定時間間距調整pH之批次發酵實驗本次實驗將仿效控制組pH自然快速下降的變化來測試產物產量和生產速率的影響。培養並利用5N NaOH在固定時間間距分別為12小時和24小時調整槽內發酵液的pH值，調整為7.0，直到pH不再下降至7.0以下。由圖4-6可以發現，當pH被調整為7.0之後12小時之內即又下降，所以此方法可以有效地強迫pH產生震盪變化。實驗結果如圖4-28所示，此強迫p

H來回震盪的方法確實可以提升BDO的生產速率，但依舊無法提高BDO的產量，推測是因為碳源甘油快速地被消耗，以至於產量無法繼續提升；PDO方面，此方法跟固定pH值一樣有利於PDO的生產，甚至效果更好。比較兩種不同時間間距所得到的數據，在主要代謝產物方面，以24小時調整一次的效果比12小時調整一次較佳，因為pH值12小時內掉回5.0以下，在pH維持 5.0以下的時間會長達12小時，此環境是有利於BDO的生長，所以BDO的產量會較好。因此pH的強迫震盪是可以有效刺激BDO、PDO，提升生產速率，而不同的pH環境，更可以提升各別的產量。圖4-6 固定時間間距調整pH之比較4-3 5-L攪拌式發酵槽饋

料批次程序 (Fed-batch)4-3-1 固定時間間距調整pH之饋料批次發酵實驗由4-2-3批次實驗得到每24小時調整pH至7.0可有效的提升BDO、PDO的生產速率，但因為碳源在96小時內快速消耗，以致無法持續提升BDO的產量。因此本實驗以每24小時調整pH值之間隔式饋料批次發酵策略來改善主要代謝產物產量不佳的問題。但間隔式饋料是具有產物延遲累積的問題，並用連續式饋料作為改善。由圖4-30可會發現連續式饋料確實可改善產物延遲累積的問題，且饋料批次也能以提升主要代謝產物產量，BDO的最大濃度由14.3 g/L 增加至20 g/L，PDO也更從30.1 g/L提升至54.8 g/L。。圖4-

7 饋料批次之比較五、結論由搖瓶實驗可知，甘油可以提高菌體濃度且得到較好的Total Diols。在培養基中添加乳酸能有效提升Total Diols約30 %。而包埋法之固定化細胞重複批次實驗可以重複四次批次實驗，前三次批次BDO和PDO都可以維持在20 g/L、11 g/L；第四次批次凝膠球則會破裂。細胞固定化對產物的生產沒有提升效果但有利進行微生物細胞重複利用。5-L攪拌式發酵槽批次發酵之溶氧實驗中，高溶氧，可以獲得細胞較高的菌數量2.8 g/L、提高BDO的最大濃度30.1 g/L、生產速率0.42 g/Lh、產率0.43 g/g；低溶氧批次發酵反而有利於PDO的生產，最大濃度17.2

g/L、生產速率0.13 g/Lh、產率0.59 g/g；固定pH實驗，以pH值控制於7.0時可得較高的菌體濃度2.8 g/L、PDO的產量和生產速率明顯的提升至25.0 g/L、0.33g/Lh；固定時間間距調整pH至7.0實驗，以每24小時調整pH值至7.0相對於固定pH 7.0可有效提升BDO的生產速率(由0.13提升至0.20 g/Lh)，此方法跟固定pH值一樣有利於PDO的生產，甚至效果更好。5-L攪拌式發酵槽饋料批次發酵之固定時間間距調整pH至7.0實驗，強迫性的pH震盪有助菌體的活性，發酵液中pH的改變也可以改變甘油的代謝路徑進而提高BDO、PDO生長速率 (0.20 g/Lh、

0.42 g/Lh)，之後再利用饋料的方式，來促進BDO、PDO (20.0 g/L、54.8 g/L)產量；而兩種不同的饋料方式，差別僅於連續式饋料批次可以改善間隔式饋料批次時產物延遲生產的問題，對產物的產量並無明顯影響。參考文獻Biebl H., Zeng A.P., Menzel K., Deckwer W.D., (1998). Fermentation of glycerol to 1,3-propanediol and 2,3-butanediol byKlebsiella pneumonia. ApplMicrobiolBiotechnol, 50:24-29.Biebl H.,

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